BIOTEKNOLOGI FUSI PROTOPLASMA

Fusi Protoplasma

PENDAHULUAN

Sejarah Fusi Protoplasma

Bioteknologi adalah pemanfaatan organisme/mahkluk hidup yang dilaksanakan secara terpadu dan bertujuan untuk meningkatkan nilai guna suatu barang untuk kesejahteraan manusia.  Macam-macam bioteknologi adalah

1.    Fermentasi

2.    Kultur Jaringan

3.    Rekayasa genetika yang meliputi Teknik Rekombinansi DNA/fusi gen dan Teknik Fusi protoplasma

4.    Kloning

5.    Hidroponik

6.    Aeroponik

7.    Kawin suntik  

Dari berbagai macam biotenologi terdapat fusi protoplasma. Fusi protoplasma adalah penggabungan dua sel dari jaringan yang sama atau dua sel dari organisme yang berbeda dalam suatu medan listrik. Prinsip ini dapat dilakukan pada sel tumbuhan maupun sel hewan.

Istilah protoplasma itu pertama kali diperkenalkan oleh Hanstein pada tahun 1880, yang dimaksud dengan istilah tersebut adalah sel tumbuhan yang telah dipisahkan dari dinding selnya atau sel tumbuhan telanjang tanpa dibungkus oleh dinding sel. Protoplas dapat dimanfaatkan untuk mendukung penelitian dasar biologi tanaman dan merupakan sarana penting di bidang rekayasa genetik, misalnya untuk hibridisasi somatik untuk meningkatkan kualitas tanaman.

Fusi protoplas adalah salah satu metode persilangan atau hibridisasi tanamandengan memanfaatkan rekayasa genetika konvensional. Protoplas adalah sel tanaman tanpa bagian dinding sel. Teknik fusi protoplas dapat digunakan untuk mencampur sifat genetik dari spesies tanaman yang sama ataupun dari spesies yang berbeda. Selain itu, teknik ini menguntungkan untuk diterapkan dalam persilangan tanaman steril ataupun tanaman dengan siklus hidup yang panjang. Untuk menginduksi atau mendukung terjadinya fusi protoplas dapat dilakukan dengan pemakaian senyawa kimia sepertipolietilen glikol (PEG) ataupun penggunaan arus listrik untuk membantu fusi (elektrofusi). Ketika dua protoplas bersatu, dapat terjadi pemisahana atau penggabungan dua inti sel (nukleus) sehingga menghasilkan tanaman dengan sifat baru hasil pencampuran kedua tetua. Apabila salah satu inti sel hilang selama terjadinya fusi maka akan dihasilkan sel baru yang disebut sitoplasmik hibrid (cybrid).

Fusi protoplasma pada sel hewan dan manusia sangat berguna terutama untuk menghasilkan hibridoma. Hibridoma merupakan hasil fusi yang terjadi antara sel pembentuk antibody dan sel mieloma. Sel pembentuk antibodi ini adalah sel limfosit B, sedangkan sel mieloma sendiri merupakan sel kanker. Sel hibridoma yang dihasilkan dapat membelah secara tidak terbatas seperti sel kanker, tetapi juga menghasilkan antibodi seperti sel-sel limfosit B. Hibridoma yang dihasilkan diseleksi karena setiap sel menghasilkan antibodi yang sifatnya khas. Satu antibodi yang dihasilkan spesifik untuk satu antigen. Setiap hibrid ini kemudian diperbanyak (dikloning). Oleh karena antibodi ini berasal dari satu klon maka antibodi ini disebut antibodi monoklonal.

TINJAUAN PUSTAKA

Fusi  Protoplasma

Fusi protoplasma atau teknologi hibridoma adalah proses penggabungan dua sel dari jaringan yang sama atau dari dua sel dari organisme yang berbeda dalam suatu medan listrik. Teknik ini juga dapat digunakan untuk menghasilkan organisme transgenik. Prinsip dasar fusi protoplasma yaitu menghilangkan dinding dari kedua sel kemudian menggabungkan kedua isi sel tersebut dalam suatu medan listrik. Teknik fusi ini dapat dilakukan ada sel tumbuhan maupun hewan. Fusi protoplasma pada sel hewan atau manusia bermanfaat untuk menghasilkann hibridoma(sel hibrid). Hibridoma merupakan hasil fusi antara sel pembentuk antibodi dengan sel mieloma.Fusi protoplas dapat dilakukan dengan cara menggabungkan seluruh genom dari spesies yang sama (intra-spesies), atau antarspesies dari genus yang sama (inter-spesies), atau antargenus dari satu famili (inter-genus). Penggunaan fusi protoplas memungkinkan diperolehnya hibrida-hibrida dengan tingkat heterosigositas yang tinggi walaupun tingkat keberhasilannya sangat ditentukan oleh genotipenya (Mollers et al. 1992). Teknologi fusi protoplas juga dapat dilakukan untuk mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan penyakit serta cekaman abiotik (Purwito 1999).

Tanaman hasil fusi dapat berupa tanaman dengan sifat-sifat gabungan dari kedua tetuanya termasuk sifat-sifat yang tidak diharapkan terutama berasal dari spesies liar. Oleh karena itu, untuk menghilangkan sifat-sifat yang tidak diinginkan tersebut maka perlu dilakukan silang balik (back cross) dengan tetua budi daya. Kemajuan pesat dalam penelitian produksi hibrida somatik dan sibrida dalam transfer DNA tidak terlepas dari teknik isolasi, kultur dan regenerasi protoplas menjadi tanaman. Untuk menunjang keberhasilan teknik kultur dibutuhkan keahlian dan pengetahuan tentang teknik kultur protoplasma guna mendukung teknik pencarian varietas baru berbagai jenis tanaman.

Hibridoma adalah   fusi sel   pada   organisme tingkat tinggi yang bertujuan untuk mendapat-kan gabungan sifat kedua sel induk.

Contoh :

-      Fusi sel manusia dan tikus untuk  menghasilkan antibodi untuk pengobatan kanker.

-      Fusi sel tomat dan kentang menghasilakan tanaman baru Pomato (Potato-Tomato) yang berbuah tomat dan berumbi kentang.

Fusi protoplasma adalah penggabungan dua sel dari jaringan yang sama (organisme berbeda) dalam suatu medan listrik. Fusi protoplasma pada tumbuhan melalui tahap-tahap:

1)  menyiapkan protoplasma dari sel-sel yang masih muda karena dinding sel tipis serta protoplasma yang banyak dan utuh

2)    mengisolasi protoplasma sel dengan cara menghilangkan dinding selnya dengan menggunakan enzim kemudian dilakukan penyaringan dan sentrifugasi berkali-kali

3)    protoplasma yang didapat kemudian diuji viabilitasnya (aktivitas hidupnya) dengan cara melihat aktivitas organel, misalnya melihat aktivitas fotosintesisnya.

    

Fusi protoplasma pada tumbuhan diawali dengan menyiapkan protoplasma. Tahap selanjutnya, mengisolasi protoplasma sel yang telah dipersiapkan, protoplasma diisolasi dengan cara menghilangkan dinding selnya. Setelah itu, protplasma di uji viabilitasnya (aktivitas hidup) dengan melihat aktivitas organelnya. Fusi prooplasma dilakukan dalam suatu medan listrik. Setelah sel-sel mengalami fusi, protoplasma hasil fusi tersebut diseleksi. Prtoplasma yang terseleksi kemudian dibiakkan.

PEMBAHASAN

A. Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma

1.      Persiapan Ekspaln

Jaringan tanaman yang digunakan untuk isolasi protoplasma ini beragam, umumnya jaringan yang lebih muda dan berasal dari tanaman yang mempunyai umur fisiologis muda, seperti pucuk muda (seperti dari kecambah, bibit, plantlet), pucuk adventif hasil pangkasan.Protoplasma dari sel jaringan tersebut lebih mudah diisolasi protoplasmanya karena dinding selnya masih sederhana dan hanya terdiri dari dinding sel primer saja dan jaringannya masih memiliki sel-sel parenchyma (dindingnya belum berlignin).Selain itu, ada juga yang menggunakan jaringan yang telah dewasa, namun media untuk isolasi protoplasma dari jaringan ini lebih kompleks karena dinding selnya telah berlignin, telah memiliki dinding sel primer dan dinding sel sekunder.

Bagian tanaman yang akan digunakan sebagai eksplan terlebih dahulu dicuci kemudian disterilakan, umumnya menggunakan sodium hypoklorit 1 -2 % selama 10 - 30 menit tergantung jenis eksplan yang digunakan. Eksplan tersebut selanjutnya dicuci dengan air steril (3 - 4 kali) untuk mencuci sisa sodium hipoklorit pada eksplan.

2.      Isolasi protoplasma

Jaringan tanaman steril, diiris halus dan dikupas eidermis serta dihilangkan urat daunnya dengan menggunakan mata skalpel runcing steril, untuk lebih memudahkan isolasi protoplasmanya. Contoh campuran dan konsentrasi enzym yang digunakan untuk isolasi protoplasma beragam dan tergantung dari jenis jaringan yang digunakan sebagai eksplan, seperti:

a.       Medium enzim untuk jaringan Akar

1)   2 % rhozyme

2)   2 % meicellase

3)   0,03 % macerozyme R10

b.      Medium enzim untuk daun Serealia

1)   2 % cellulysin

2)   0,2 % macerozyme R10

3)   0,5 % hemicellullase

4)   11 % mannitol

c.       Medium enzim untuk Daun Tembakau:

1)   0,5 % Onozuka R10 cellulase

2)   0,1 % Onozuka R10 macerozyme R10

3)   13,0 Mannitol

4)   pH 5,8

Untuk mengurangi daya tarik menarik (adhesi) antara sitoplasma dengan dinding selnya, Larutan enzim biasanya ditamhkan senyawa osmoticum. Senyawa osmoticum yang dapat digunakan antara lain: Mannitol, Sorbitol, Glukosa, Fruktosa, Galaktosa, Sukrosa. Setelah dinding sel lepas, selanjutnya eksplan direndam ke dalam 20 ml larutan media preplasmolisis selama 1-8 jam. Medium preplasmolisis untuk setiap jenis eksplan berbeda, untuk tembakau medium preplasmolisis tersusun atas medium isolasi protoplasma ditambah 13% mannitol. Komponen Medium Isolasi Protoplasma (MIP) adalah sebagai berikut:

        CaCl2.H2O          1480,0 mg/l·

        KH2PO4              27,2 mgl·

                   Eksplan dipindahkan ke larutan medium enzim (komposisi media ini juga berbeda-beda untuk setiap jenis eksplan yang digunakan) untuk daun tembakau komponennya dapat dilihat di atas. Eksplan dipindah ke tabung steril dan dituangi medium enzim sebanyak 10 ml, lalu tabung ditutup dengan aluminium foil steril dan diisolasi menggunakan parafilm atau plastik wrap. Tabung berisi eksplan tersebut digoyang pada shaker dengan kecepatan 40 rpm selama semalam atau 4-16 jam.

Fusi protoplasma pada tumbuhan melalui tahap-tahap:

Peleburan protoplasma dari 2 genom yang berbeda dapat diperoleh baik secara spontan ataupun dengan teknik pemacuan peleburan.

a.  Metode peleburan spontan

Peleburan protoplasma secara spontan biasanya terjadi karena membran protoplas yang sangat tipis dan lunak sehingga mudah sobek atau pecah yang dapat mengakibatkan peleburan protoplasma. Biasanya terjadi pada protoplasma yang diisolasi dari kalus. Perleburan protoplasma dengan teknik ini biasanya terjadi pada protoplasma yang mempunyai asal tanaman yang sama sehingga tidak bernilai untuk perbaikan tanaman.

b.   Metode pemacuan peleburan

Untuk mencapai peleburan protoplasma diperlukan adanya agensia untuk memacu terjadinya peleburan protoplasma (dikenal sebagai fusagen) yang berbeda jenis tanamannya. Larutan fusagen contohnya:

  ·Perlakuan dengan sodium nitrat: 5,5% sodium nitrat dalam larutan 10% sukrose dan kultur diinkubasikan dalam water bath bersuhu 35o C selama 5 menit selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 200 g selama 5 menit. Subernatan dibuang dan pelet disimpan dalam water bath bersuhu 35o C selama 30 menit. Pada beberapa saat protoplasma akan terjadi peleburan.  Agregat ditiangkan secara hati-hati pada medium kultur yang telah ditambah 0,1% NaNO3.  Teknik ini akan dihasilkan dengan frekuensi rendah bila asal protoplasmanya dari mesofil daun.

  ·Perlakuan ion calsium padas pH tinggi . Teknik ini telah digunakan pada protoplasma tembakau. Caranya protoplasma yang telah diisolasi ditambahkan larutan fusagen berupa 0,5 M mannitol yang berisi 0,05 M CaCl2.2H2O pada pH 10,5 selanjutnya disentrifuge dengan kecepatan 50 g selama 3 menit. Selanjutnya tabung sentrifuge disimpan dalam water bath bersuhu 37o C selama 40-50 menit hingga protoplasma melebur.

  ·Perlakuan polyethelene glycol (PEG). Dari sekian banyak metode peleburan protoplasma, metode ini yang yang berhasil dengan baik untuk melebur protoplasma.  

Suspensi protoplasma dilarutkan dalam larutan PEG: 1 ml suspensi protoplasmadalam medium kultur dicampur dengan 1 ml 28-56% PEG (1500-6000 MW). Tabung digoyang selama 5 detik dan biarkan berhenti 10 menit. Selanjutnya suspensi protoplasma tersebut dipindahkan dari larutan PEG dengan cara mencucinya menggunakan medium kultur sebanyak 2 kali. Hasil peleburan protoplasma ini berupa pembentukan heterokarion dengan frekuensi yang tinggi, sedangkan kebanyakan tipe sel sitoplasmik dengan pembentukan hetekarion binukleat rendah.  Protoplasma yang didapat kemudian diuji viabilitasnya (aktivitas hidupnya) dengan cara melihat aktivitas organel, misalnya melihat aktivitas fotosintesisnya.

Fusi protoplas dapat menghasilkan dua macam kemungkinan produk:

 ü Hibrid, jika nukleus dari kedua spesies tersebut betul-betul mengalami fusi (menyatu)

 ü Cybrid (cytoplasmid hybrid ataru heteroplast), jika hanya sitoplasma yang mengalami fusi sedangkan informasi genetik dari salah satu induknya hilang.

B.   Manfaat Fusi Protoplasma

1.    Teknik fusi protoplas dapat digunakan untuk mencampur sifat genetik dari spesiestanaman yang sama ataupun dari spesies yang berbeda.

2.    Teknik ini menguntungkan untuk diterapkan dalam persilangan tanaman sterilataupun tanaman dengan siklus hidup yang panjang.

3.    Teknologi fusi protoplas juga dapat dilakukan untuk mendapatkan sifat-sifat tertentu seperti sifat ketahanan terhadap hama dan penyakit serta cekaman abiotik.

Hubungan metabolit sekunder dengan fusi protoplasma, yaitu saat terjadi penggabungan antar protoplas akan menghasilkan varietas baru. Dimana varietas tersebut diharapkan dapat mempertahankan ataupun meningkatkan jumlah metabolit sekunder dari tiap protoplasma yang diinduksi.

PENUTUP

Adapun kesimpilan yang dapat diambil dari makalah ini adalah sebagai berikut

1.        Fusi protoplas adalah salah satu metode persilangan atau hibridisasi tanamandengan memanfaatkan rekayasa genetika konvensional.

2.      Fusi protoplasma pada tumbuhan melalui tahap-tahap:

1)  menyiapkan protoplasma dari sel-sel yang masih muda karena dinding sel tipis serta protoplasma yang banyak dan utuh

2) mengisolasi protoplasma sel dengan cara menghilangkan dinding selnya dengan menggunakan enzim kemudian dilakukan penyaringan dan sentrifugasi berkali-kali

3) protoplasma yang didapat kemudian diuji viabilitasnya (aktivitas hidupnya) dengan cara melihat aktivitas organel, misalnya melihat aktivitas fotosintesisnya.

3.        Fusi protoplasma pada tumbuhan diawali dengan menyiapkan protoplasma. Tahap selanjutnya, mengisolasi protoplasma sel yang telah dipersiapkan, protoplasma diisolasi dengan cara menghilangkan dinding selnya.

4.        Tahapan pengerjaan isolasi protoplasma

a.        Persiapan Ekspaln

b.    Isolasi protoplasma

 DOWNLOAD SLIDE PERSENTASI